双委夜蛾气味结合蛋白AdisOBP6的原核表达抗体制备及表达谱分析

【目的】本研究旨在对双委夜蛾Athetis dissimilis气味结合蛋白OBP6进行原核表达、抗体制备以及表达谱分析,便于今后对AdisOBP6功能展开研究。【方法】利用生物信息学软件分析AdisOBP6蛋白结构特征;利用通过原核表达获得的重组蛋白4次免疫新西兰大白兔,制备AdisOBP6抗体;采用荧光定量PCR和Western blot技术检测AdisOBP6在双委夜蛾雌雄成虫触角、不同时期精巢以及受精卵和未受精卵中的表达情况。【结果】同源建模预测显示,AdisOBP6具有6个保守半胱氨酸残基和7个α-螺旋结构,并 折叠成一个结合口袋。原核表达结果显示,在20℃下0.5 mmol/L IPTG诱导重组蛋白表达量最多、最稳定。4次免疫重复中,抗体效价分别超过1∶512 000, 1∶512 000, 1∶512 000和1∶64 000。Westernblot检测获得的抗体与AdisOBP6蛋白能够特异性结合。荧光定量PCR结果显示,AdisOBP6在双委夜蛾精巢中的表达量远高于在触角中的,在幼虫期精巢中AdisOBP6就已经开始表达,在蛹期精巢中表达量低于在幼虫期的, 成虫羽化后精巢中的表达量逐渐进入高峰,在未受精卵和受精卵中几乎不表达或表达量极低。Western blot分析发现,AdisOBP6蛋白也主要在精巢中表达,在雌雄成虫触角、受精卵和未受精卵中表达量很低。【结论】本研究实现了AdisOBP6的原核表达,成功地制备了抗体;并证实AdisOBP6在双委夜蛾精巢中大量表达,成虫羽化后表达量达到高峰,推测AdisOBP6可能参与了授精过程。本研究结果为今后进一步研究AdisOBP6的功能奠定了基础。     

二点委夜蛾非典型嗅觉受体AlepOrco的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

【目的】非典型嗅觉受体(olfactory receptor co-receptor, Orco)与典型嗅觉受体共同形成离子通道,在昆虫嗅觉识别中具有至关重要的作用。本研究旨在克隆和表达二点委夜蛾Athetis lepigone Orco基因,明确其分子特性,为进一步研究该基因在二点委夜蛾中的功能奠定基础。【方法】将二点委夜蛾雌雄成虫触角转录组数据建立本地数据库,通过生物信息学分析获得二点委夜蛾Orco同源基因AlepOrco;利用RT-PCR方法克隆二点委夜蛾AlepOrco基因全长,并在pGEX-6P-1/BL21(DE3)系统中进行了该基因开放阅读框(ORF)的原核表达,制备多克隆抗体,用Western blot检测抗体特异性;利用qPCR技术检测该基因在二点委夜蛾雌雄成虫不同组织(喙、触角、去除触角和喙的头、胸、腹、足和翅)中的表达谱。【结果】获得了二点委夜蛾AlepOrco的cDNA(GenBank登录号:MN583125)全长序列,开放阅读框长1 422 bp,编码473个氨基酸,序列中有7个跨膜结构区,预测等电点为8.59,分子量为53.40 kD。SDS-PAGE和Western blot分析结果表明AlepOrco能够在大肠杆菌Escherichia coli中高效表达。利用制备的多克隆抗体对二点委夜蛾AlepOrco进行Western blot检测,其能够特异识别成虫触角中AlepOrco蛋白。qPCR结果表明,AlepOrco在二点委夜蛾雌雄成虫不同组织间具有相似的表达模式,都是在触角中的相对表达量最大,在翅中的表达量最小。【结论】克隆并原核表达了二点委夜蛾非典型嗅觉受体基因AlepOrco,制备的多克隆抗体能够特异识别二点委夜蛾成虫触角中的AlepOrco。结果为深入了解二点委夜蛾AlepOrco基因的结构和功能奠定了基础。     

温度对双委夜蛾种群生态学特征的影响

【目的】双委夜蛾Athetis dissimilis(Hampson)是新发现的一种农业害虫,为探索温度对双委夜蛾生长发育和繁殖的影响。【方法】在室内l6,21,26,30,34(±1)℃,RH为70%±5%、光周期为14L︰10D条件下,测定了双委夜蛾各发育阶段的发育历期、存活率及成虫产卵量,组建了双委夜蛾的实验种群生命表。【结果】结果表明,双委夜蛾各虫态的发育历期随温度的升高而缩短;世代发育起点温度(C)为9.88℃,有效积温(K)为906.53日·度;卵的孵化率在不同的温度下无显著差异;幼虫存活率、化蛹率和羽化率则以21~30℃为最高;成虫的产卵量以21~26℃为最高,而在16℃和30℃时显著降低,在34℃下成虫不能交配,30℃成虫交配率仅为46%;生命表分析表明,26℃双委夜蛾的种群趋势指数和内禀增长率取得最大值,分别为98.5和0.1。【结论】21~26℃是最适宜双委夜蛾生长发育和繁殖的温度范围。     

中国委夜蛾属二新种记述(鳞翅目,夜蛾科,木冬夜蛾亚科)

通过对西藏夜蛾科标本的研究发现委夜蛾属2新种,墨脱委夜蛾Athetis motuoensis sp.nov.和汉密委夜蛾Athetis hanmiensis sp.nov.。文中提供西藏地区委夜蛾属的分种检索表和新种特征图及新种的详细描述。模式标本保存在东北林业大学标本室。墨脱委夜蛾,新种Athetis motuoensis sp.nov.(图1,3,5,7)本种外部形态上与条委夜蛾相似,仅前翅基部、内横线区、外横线区、外缘区和中横线暗褐色。主要区别于外生殖器上:爪形突宽短;抱器端窄而圆;抱器背延伸发达,超过抱器腹缘,末端较细;抱器内突在距抱握器基部3/4处出发,可达抱握器顶端;阳茎轭片脊部短而宽,中部平滑,下端部宽圆;囊形突较窄,略呈V形;阳茎逐渐弯曲,在末端着生有硬化的齿,龙骨稍硬化且细而长;阳茎端膜基囊中等大小,在角状突带的起始部位着生有5个长而粗大的角状突。正模雄性,西藏墨脱,海拔2100m,2005-08-24~26,黄灏、周达康、唐亮采,玻片编号HHL-1012。副模:5♂♂,3♀♀,其它采集资料同正模,雌性玻片编号HHL-1011。词源:以新种模式产地命名。汉密委夜蛾,新种Athetis hanmiensis sp.nov.(图2,4,6,8)本种外部形态上与A.suffusa(Yoshimoto,1994)相似,仅前翅红褐色明显。主要区别于外生殖器上:爪形突相对大一些;抱器端宽而平直;抱器背延伸发达,末端较细,在抱器腹缘末端伸出;抱器内突在距抱握器基部3/5处出发,可达抱握器顶端;阳茎轭片较大,脊部长而宽,中下端部宽圆;囊形突较窄,呈明显的V形;阳茎逐渐变细,龙骨硬化重且细而长;阳茎端膜基囊中等大小,具有1个小角状突,在角状突带的起始部位着生有6个长而粗大的角状突。正模雄性,西藏汉密,海拔2000m,2005-08-19~23,黄灏、周达康、唐亮采,玻片编号HHL-1017。副模:4♂♂,6♀♀,其它采集资料同正模,雌性玻片编号HHL-1016。词源:以新种模式产地命名。     

对二点委夜蛾高毒力苏云金芽胞杆菌的筛选及其基因型分析

【目的】获得对二点委夜蛾Athetis lepigone(M(o|¨)schler)高毒力的苏云金芽胞杆菌(Bt)菌株,寻找对该虫具有特异杀虫活性的蛋白毒素,探索Bt菌株或其杀虫基因应用于二点委夜蛾防治的可行性。【方法】通过生物测定方法比较了36株苏云金芽胞杆菌和一株恶臭假单胞工程菌PHB-cry1Ab对二点委夜蛾幼虫的杀虫活性,同时利用PCR-RFLP方法对这些菌株的基因型进行了分析。【结果】不同Bt菌株对二点委夜蛾幼虫的杀虫活性差别很大,杀虫活性高的菌株都含有cry1Ac基因。饲毒72 h后含单基因的BtHD-73菌株(cry1Ac)对二点委夜蛾2龄幼虫的毒力(LC_(50)值为188.51μg/g)明显高于含多基因的Bt SC-40菌株(cry1Ac,cry2Ac,cry1I,vip3A)的毒力(LC_(50)值为418.13μg/g)。含有vip3A基因的Bt SC-40和BtHD-13营养期上清液对二点委夜蛾2龄幼虫表现出一定的杀虫活性(72 h死亡率分别达到42.5%和57.4%),而无vip3A基因的Bt HD-73营养期上清液未表现出明显的杀虫活性。【结论】由cry1Ac基因编码的Cry1Ac蛋白对二点委夜蛾幼虫具有特异杀虫活性,Vip3A蛋白对二点委夜蛾幼虫可能也有一定的杀虫活性。     

二点委夜蛾飞行行为特征

【目的】本研究旨在阐明二点委夜蛾的飞行行为特征,丰富二点委夜蛾飞行生物学理论,提高其预测预报水平。【方法】利用昆虫飞行磨被动吊飞系统和主动飞行监测系统,系统研究了二点委夜蛾Athdtis lepigone(M(o|¨)schler)被动飞行能力和主动飞行意愿。【结果】成虫具有较强的被动飞行潜力。室内连续吊飞80 h,雌雄蛾最远飞行距离分别达106.71 km和148.32 km,最长飞行时间分别达43.05 h和40.01h,最快飞行速度分别达7.60 km/h和8.14 km/h。雄蛾飞行潜力显著强于雌蛾,体现在飞行距离和飞行时间显著高于雌蛾,但飞行速度差异不显著。成虫蛾龄显著影响成虫飞行能力。对不同蛾龄成虫吊飞12 h的结果表明,1日龄即具备一定的飞行能力,之后逐渐增强,3日龄时飞行能力最强,雌雄蛾平均飞行距离分别为29.61 km和27.55 km,飞行时间分别为10.04 h和9.46 h,平均飞行速度分别达2.76 kn/h和2.46km/h,4日龄成虫飞行能力开始下降,但不同性别间成虫飞行能力差异不显著。蛾龄间飞行能力差异主要是由于不同蛾龄成虫的强、弱飞行个体比例不同。二点委夜蛾主动飞行呈现明显的节律行为,飞行活动主要集中在暗期(19:00—次日5:00),在光期(5:00—19:00)基本不飞行。成虫初羽化(1日龄)主动飞行意愿增强,之后飞行活动减少,但产卵开始时主动飞行活动又开始增强,到7日龄达到峰值。【结论】二点委夜蛾成虫具有较强的飞行能力,其飞行能力受蛾龄,雌雄等因素影响;飞行具有明显的节律性。     

温度对双委夜蛾实验种群生长发育及繁殖的影响

【目的】双委夜蛾Athetis dissimilis(Hampson)是近几年在中国大陆新发现的农业害虫,与二点委夜蛾Athetis lepigone(Mschler)形态相似,危害特点相同。明确温度对其生长发育的影响,对该害虫的预测预报和有效防控具有重要的指导意义。【方法】在光周期16L∶8D,RH 70%±10%的实验室条件下,设置17,21,25,29和33℃5个恒定温度,饲喂人工饲料,研究温度对双委夜蛾发育历期、死亡率及繁殖的影响,并计算各虫态的发育起点温度和有效积温。【结果】在17~33℃范围内,双委夜蛾均可以完成整个世代,各虫态发育历期随温度的升高而缩短;17和21℃下,双委夜蛾幼虫有7个龄期,而25℃以上时幼虫只有6个龄期。25℃下双委夜蛾死亡率最低(21.00%),单雌产卵量最高(763.95粒)。整个世代的发育起点温度和有效积温分别为9.38℃和1 015.36日·度。雌雄虫寿命和产卵期随温度的升高逐渐缩短,且各温度下雌虫寿命均较雄虫长,性比(雄雌比)均在1.18~1.20之间。【结论】25℃是双委夜蛾实验种群生长发育和繁殖的适宜温度。     

基于线粒体COⅠ基因序列的中国二点委夜蛾遗传多态性分析

二点委夜蛾Athetis lepigone是2005年首次在河北省发现危害夏玉米苗的新害虫, 2011年7月在河北、 河南、 山东、 山西、 安徽和江苏6省47市夏玉米苗期大面积暴发成灾, 严重威胁玉米生产。为了从种群水平探讨该虫暴发成灾的机制, 我们通过分析线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(mtCOⅠ）基因序列来研究不同地区二点委夜蛾种群的进化关系。本研究采集了河北、 河南、 山东和山西等地的19个不同地理种群样本, 用同源序列比对的方法分析样本mtCOⅠ基因片段, 利用DnaSP 5.0软件和Arlequin 3.5软件对不同地理种群间的mtCOⅠ单倍型多样性分析和Tajima’s D中性检测, 建立了单倍型邻接（N-J）系统发育进化树和单倍型网络图。结果表明, 在203头个体的658 bp mtCOⅠ基因片段中, 得到17种单倍型和18个变异位点, 河北省的二点委夜蛾的单倍型多态性最丰富, 而河南、 山东和山西3省采集的二点委夜蛾样品其单倍型均有与河北种群单倍型一致的类型。二点委夜蛾不同地理种群间基因流水平较高, 种群间没有明显的遗传分化, 并且在较近的历史时期未经历明显的种群扩张。     

不同变温组合条件下二点委夜蛾的生长发育

【目的】为明确变温条件对二点委夜蛾Athetis lepigone (Möschler) 实验种群生长发育的影响。【方法】分别设置6个变温组合（20/24℃, 20/28℃, 20/32℃, 24/28℃, 24/32℃和28/32℃）,通过测定和计算各虫态发育起点温度和有效积温及生命表参数来研究变温对二点委夜蛾卵、幼虫、蛹、世代平均发育历期、存活率和繁殖力的影响。【结果】不同变温组合对二点委夜蛾各虫态的发育历期、存活率及种群繁殖力有显著影响。发育历期随着变温组合平均温度的升高而缩短,二点委夜蛾世代存活率由大到小的顺序为24/28℃>20/32℃>28/32℃>20/28℃>24/32℃>20/24℃。24/28℃时产卵量最高,单雌产卵量为390.70粒。世代发育起点温度和有效积温分别为10.37℃和663.17日·度。在不同变温组合下内禀增长率r_m值随着平均温度的升高先上升后降低。在24/28℃时,二点委夜蛾r_m、净增殖率R₀和周限增长率λ最大,种群加倍时间 t 和世代平均周期 T 最小。【结论】24/28℃是二点委夜蛾实验种群生长发育及繁殖的最适变温组合,本研究结果为二点委夜蛾的预测预报及综合防治提供了科学依据。